蛋白质样品三级预处理系统的开发
复杂体系例如基因组、转录组和蛋白组的分析面临巨大挑战：成分及其复杂、含量差别巨大、理化性质不同以及时空动态变化等，亟需分离分析化学领域的技术突破。其中样品预处理是解决问题的关键过程。报告从高丰度蛋白质去除、低丰度蛋白质富集、膜蛋白增溶以及集成化蛋白质样品预处理装置等四个预处理关键技术角度，讨论提高复杂分析体系灵敏度、效率以及效果的可行性。以高丰度蛋白质去除为例，现有技术包括离心超滤、蛋白质均衡技术、色谱分级或者抗体等技术，分别存在选择性差、丢失部分蛋白质信息、中低丰度蛋白质丢失、去除高丰度蛋白质时同时丢失大量中低丰度蛋白稳定性差寿命短等问题，而新策略则是针对现有去除高丰度蛋白的单一技术的不足，通过构建蛋白质样品多级预处理系统包括采用稳定性好的人工抗体材料去除超高丰度蛋白质，提高后续处理的上样量；采用多维阵列液相色谱批量去除高丰度蛋白质，提高处理通量；采用基于新型配基的蛋白质分级技术，避免高丰度蛋白质馏分中低丰度蛋白质的损失。以血浆蛋白为例，原始血浆如果直接分析，最高浓度 4.1×107(ALBU_HUMAN)/ng/mL，最低浓度3.6×1038（DEF1_HUMAN）；经过三级系统处理后则分别达到4.1×107(ALBU_HUMAN)；2.0×10-1（CXCL7_HUMAN）/ng/mL，动态范围从原始4个数量级提高到8个数量级。再以定量蛋白质组分析为例，现有技术存在不少问题，例如离线多步操作影响定量的准确度、精密度、通量和灵敏度；自由溶液中的化学标记通常存在标记不完全、费时等问题；采用固定化酶反应器在线酶解存在非特异性吸附和漏切等问题。基于此，通过集成化定量蛋白质组分析平台的开发应对挑战：课题组发展了集成化的蛋白质预处理系统，提高蛋白质的鉴定覆盖率以及分析通量，使样品处理时间下降到1/420，而序列覆盖率上升了2-3倍；对蛋白质组样品进行在线变性、还原、除盐和酶解，结合多维分离鉴定系统，构建了一种基于SILAC标记的集成化蛋白质组学相对定量平台样品预处理时间从离线288h缩短到在线68min；样品首先经IMER进行在线酶解，酶解肽段进入C18捕集柱上实现固相二甲基化标记，结合多维分离鉴定系统，构建了一种基于二甲基化标记的集成化蛋白质组学相对定量平台。通过上述多个角度的探索，大幅度提高了复杂分析体系分析测试的灵敏度、效率、准确度和精密度。
（张玉奎院士 中国科学院大连化学物理研究所）